ಆರ್ಎನ್ಎ ಪತ್ತೆಗಾಗಿ ಆರ್ಟಿ-ಪಿಸಿಆರ್ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೇಗೆ ಸುಧಾರಿಸುವುದು

ಆನುವಂಶಿಕ ಅಧ್ಯಯನಗಳನ್ನು ನಡೆಸುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ, ನಾವು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ಸಾಕಷ್ಟು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಎದುರಿಸುತ್ತೇವೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಸಣ್ಣ ಅಂಗರಚನಾಶಾಸ್ತ್ರದ ಮೌಖಿಕ ಗೆಡ್ಡೆಗಳು, ಏಕ-ಕೋಶ ಮಾದರಿಗಳು ಮತ್ತು ಮಾನವ ಜೀವಕೋಶಗಳಲ್ಲಿ ಅತ್ಯಂತ ಕಡಿಮೆ ಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ನಕಲು ಮಾಡಲಾದ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಜೀನ್ ರೂಪಾಂತರಗಳ ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ಅಧ್ಯಯನ ಮಾಡಲು.ಸಹಜವಾಗಿ, COVID-19 ಪರೀಕ್ಷೆಗಾಗಿ, ಸ್ವ್ಯಾಬ್‌ಗಳು ಸರಿಯಾದ ಸ್ಥಳದಲ್ಲಿ ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ಮಾದರಿಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಸಾಕಷ್ಟು ಸಮಯವಿಲ್ಲದಿದ್ದರೆ, ಮಾದರಿ ಗಾತ್ರವು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆ ಇರುತ್ತದೆ, ಅದಕ್ಕಾಗಿಯೇ ಆರೋಗ್ಯ ಮತ್ತು ಕುಟುಂಬ ಯೋಜನೆ ಆಯೋಗವು ಎರಡು ದಿನಗಳ ಹಿಂದೆ ಹೊರಬಂದಿತು ಮತ್ತು ಪರೀಕ್ಷೆಯಲ್ಲಿ ಉತ್ತೀರ್ಣರಾದರು ಮತ್ತು ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಸಿಡ್ ಮಾದರಿಯು ಆರು ಮಾದರಿಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಕೊಳ್ಳದಿದ್ದರೆ, ನೀವು ಅದನ್ನು ವರದಿ ಮಾಡಬಹುದು.

ಕಾರಕದ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯು ಮುಖ್ಯವಾಗಿದೆ ಏಕೆಂದರೆ ನಮಗೆ ಈ ಸಮಸ್ಯೆ ಅಥವಾ ಸಮಸ್ಯೆ ಇದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ RT-PCR ನ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಸುಧಾರಿಸಲು ನಾವು ಏನು ಮಾಡಬಹುದು?

ನಾವು ಸಂಭವನೀಯ ಪರಿಹಾರಗಳನ್ನು ಚರ್ಚಿಸುವ ಮೊದಲು, ನಾವು ಪ್ರಸ್ತಾಪಿಸಿದ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಯೊಂದಿಗೆ ಎರಡು ದೊಡ್ಡ ತೊಡಕುಗಳನ್ನು ಉಲ್ಲೇಖಿಸೋಣ.

ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ನಮ್ಮ ಮಾದರಿಯಲ್ಲಿ ಕೆಲವೇ ಜೀವಕೋಶದ ಜನಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿರುವಾಗ ನಾವು ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ನಷ್ಟದ ಬಗ್ಗೆ ಚಿಂತಿಸುತ್ತೇವೆ.ಸಾಂಪ್ರದಾಯಿಕ ಬೇರ್ಪಡಿಕೆ ಮತ್ತು ಶುಚಿಗೊಳಿಸುವ ವಿಧಾನಗಳನ್ನು ಬಳಸಿದರೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಕಾಲಮ್ ವಿಧಾನ ಅಥವಾ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಅವಕ್ಷೇಪನ ವಿಧಾನ, ಕೆಲವು ಮಾದರಿಗಳು ಕಳೆದುಹೋಗುವ ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ.tRNA ಯಂತಹ ವಾಹಕ ಅಣುವನ್ನು ಸೇರಿಸುವುದು ಒಂದು ಪರಿಹಾರವಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ನಮ್ಮ ಮರುಪಡೆಯುವಿಕೆ ಪ್ರಯೋಗವು ಸರಿಯಾಗಿದೆ ಎಂಬುದಕ್ಕೆ ಯಾವುದೇ ಗ್ಯಾರಂಟಿ ಇಲ್ಲ.

ಹಾಗಾದರೆ ಉತ್ತಮ ಮಾರ್ಗ ಯಾವುದು?ಕಲ್ಚರ್ಡ್ ಜೀವಕೋಶಗಳು ಅಥವಾ ಸೂಕ್ಷ್ಮ ಅಂಗರಚನಾಶಾಸ್ತ್ರದ ಮಾದರಿಗಳಿಗೆ ನೇರವಾದ ಲೈಸಿಸ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಉತ್ತಮ ಆಯ್ಕೆಯಾಗಿದೆ.

5 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಕೋಶಗಳನ್ನು ವಿಭಜಿಸುವುದು, ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಯನ್ನು ದ್ರಾವಣಕ್ಕೆ ಬಿಡುಗಡೆ ಮಾಡುವುದು, ನಂತರ 2 ನಿಮಿಷಗಳ ಕಾಲ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯನ್ನು ನಿಲ್ಲಿಸುವುದು, ನಂತರ ಲೈಸೇಟ್ ಅನ್ನು ನೇರವಾಗಿ ರಿವರ್ಸ್ ಟ್ರಾನ್ಸ್‌ಕ್ರಿಪ್ಷನ್ ರಿಯಾಕ್ಷನ್‌ಗೆ ಸೇರಿಸುವುದು, ಇದರಿಂದ ಯಾವುದೇ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎ ಕಳೆದುಹೋಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ಅಂತಿಮವಾಗಿ ಪರಿಣಾಮವಾಗಿ ಸಿಡಿಎನ್‌ಎ ಹಾಕುವುದು ನೈಜ-ಸಮಯದ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗೆ.

ಆದರೆ ಸೀಮಿತ ಆರಂಭಿಕ ಹಂತ ಅಥವಾ ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದ ಗುರಿ ಜೀನ್ ಅಭಿವ್ಯಕ್ತಿಯ ಕಾರಣದಿಂದಾಗಿ, ನಾವು ಎಲ್ಲಾ ಆರ್‌ಎನ್‌ಎಗಳನ್ನು ಮರುಬಳಕೆ ಮಾಡಬಹುದು ಮತ್ತು ಉತ್ತಮ ನೈಜ-ಸಮಯದ ಸಂಕೇತವನ್ನು ಪಡೆಯಲು ಸಾಕಷ್ಟು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳನ್ನು ಒದಗಿಸದಿದ್ದರೆ ಏನು?

ಈ ಸಂದರ್ಭದಲ್ಲಿ, ಪೂರ್ವ ವರ್ಧನೆಯ ಹಂತವು ತುಂಬಾ ಉಪಯುಕ್ತವಾಗಿದೆ.

ಹಿಮ್ಮುಖ ಪ್ರತಿಲೇಖನದ ನಂತರ ಸೂಕ್ಷ್ಮತೆಯನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸುವ ಯೋಜನೆಯು ಈ ಕೆಳಗಿನಂತಿದೆ.ಪ್ರಾರಂಭಿಸುವ ಮೊದಲು, ಪೂರ್ವ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ಈ ಗುರಿಗಳಿಗೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲು ನಾವು ಯಾವ ಗುರಿಗಳಲ್ಲಿ ಆಸಕ್ತಿ ಹೊಂದಿದ್ದೇವೆ ಎಂಬುದನ್ನು ನಾವು ಕೆಳಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಕೇಳಬೇಕಾಗಿದೆ.

100 ಜೋಡಿ ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳೊಂದಿಗೆ ಮಿಶ್ರ ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು 10 ರಿಂದ 14 ಬಾರಿ ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಚಕ್ರವನ್ನು ರಚಿಸುವ ಮೂಲಕ ಇದನ್ನು ಸಾಧಿಸಬಹುದು.ಆದ್ದರಿಂದ, ಪಡೆದ cDNA ಯನ್ನು ಪೂರ್ವ-ವರ್ಧಿಸಲು ಈ ಅವಶ್ಯಕತೆಗಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಾಗಿ ವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಲಾದ ಮಾಸ್ಟರ್ ಮಿಕ್ಸ್ ಅಗತ್ಯವಿದೆ.

10 ಮತ್ತು 14 ರ ನಡುವೆ ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿಸಲು ಕಾರಣವೆಂದರೆ ಈ ಸೀಮಿತ ಸಂಖ್ಯೆಯ ಚಕ್ರಗಳು ವಿವಿಧ ಗುರಿಗಳ ನಡುವೆ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕತೆಯನ್ನು ಖಚಿತಪಡಿಸುತ್ತದೆ, ಇದು ಪರಿಮಾಣಾತ್ಮಕ ಆಣ್ವಿಕ ಮಾಹಿತಿಯ ಅಗತ್ಯವಿರುವ ಸಂಶೋಧಕರಿಗೆ ನಿರ್ಣಾಯಕವಾಗಿದೆ.

ಪೂರ್ವ-ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ನಂತರ, ನಾವು ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ cDNA ಅನ್ನು ಪಡೆಯಬಹುದು, ಇದರಿಂದಾಗಿ ಹಿಂಬದಿಯಲ್ಲಿ ಪತ್ತೆ ಸಂವೇದನೆಯು ಹೆಚ್ಚು ಸುಧಾರಿಸುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಸಂಭವನೀಯ ಯಾದೃಚ್ಛಿಕ ದೋಷಗಳನ್ನು ತೆಗೆದುಹಾಕಲು ನಾವು ಮಾದರಿಯನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸಬಹುದು ಮತ್ತು ಅನೇಕ ನೈಜ-ಸಮಯದ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಗಳನ್ನು ಮಾಡಬಹುದು.